Hall i Holy Rood Palace. Han siger, at byen har optøjer. En person, der ikke kender ham i spidsen af mængden - mumre, maskerede, dansere med klokker, mennesker i sorte hætte - truede, forudsagde og opfordrede folk til ikke at adlyde dronningen. Dommer af dronning Riccio bekræfter, at han også fra tid til anden holder øje med, mens folk ivrig lytter til disse prædikener. På siden fortælles endvidere, at folket brast ud i dronningens kapel og råbte: ”Papistens rede!”, At buffeen af Darnley, dronningens mand, sprang op på alteret og begyndte at foregive at være en prædiken, og folket svarede ham med spottende vers. Dronning Mary Stuart i fortvivlelse. Hun føler folkets had; de fleste af hovmændene har forladt hende; hun undrer sig over, hvordan hendes kristendom kan være så forskellig fra kristendommen blandt Skotlands befolkning. Riccio foreslår straks at forberede et dekret, der straffer de, der er ansvarlige for oprørene. Maria dikterer sin side, siden tydeliggør, om man skal indtaste navnet på Heinrich Darnley, dronningens mand. Mary tøver; hun har mistanke om, at oprørene var inspireret af ham - trods alt blev mængden ført af kongens bøffel. Her minder Riccio om, at hun er dronningen; hun er som solen, og hun har ret til at straffe fra Gud. Han kræver straks at ringe til toldvæsenet for at meddele dronningens dekret. Douglas kommer ind. Maria beder ham om at tage papiret til Royal Chancellor Morton, så han ville stemple. Douglas scanner dekretet og ser, at det ikke har navnet på kongen. Han spørger dronningen om dette. Riccio er ansvarlig for hende. Douglas mister besindelsen. Han opfordrer dronningen til ikke at bruge blodig undertrykkelse, antyder, at han ser dette som fransk eller italiensk indflydelse. Men dronningen minder ham koldt om sin magt til at fjerne de motiver, der er ulydige mod hendes vilje. En krangel bryder ud mellem Riccio og Douglas, Douglas udfordrer Riccio til en duel og sværger for, at han dræber venetianeren i morgen. Dronningen forlader og tager Riccio væk. Douglas bliver alene, han overvejer en duel. Morton går ind. Douglas viser ham dekretet. Morton er ubeslutsom: han er bange for både kongen og dronningens vrede. Uden stempling byder Morton kongen. På dette tidspunkt blev Henry engageret i en samtale med sin jester Nick, der driller ham med det faktum, at dronningen har reel magt i Skotland, og Henry er kun hendes mand, at dronningen vælger nære, for eksempel denne italienske harpist Riccio ... På dette tidspunkt Morton bringer et uheldigt dekret. Konge i vrede beslutter han at dræbe Riccio. Kong Lindsay kommer ind på banen, han kalder kongen for at jage med den nyligt erhvervede falke. Morton svarer, at kongen allerede har en besættelse i dag. Lindsay tilslutter sig villigt komplottet mod Riccio. Han forbyder bogstaveligt talt at dræbe Riccio i aften, fordi han skal dræbe ham i morgen. Derefter henstiller Henry, når han drager fordel af forsinkelsen, senderen til astrologen for at finde ud af, hvad stjernernes placering er for hans intentioner.
Astrologen i sit laboratorium (han er også en alkymist) argumenterer med sig selv, at erfaringen bekræfter videnskabens formålsløshed, dette formål, stjernenes vilje dominerer mennesket, bortskaffer godt og ondt. Nick kommer ind, drysser med vittighed, astrologen er ikke ringere end ham. Nick rapporterer, at kongen sendte ham for at spørge om Riccios skæbne og fortæller astrologen at forudsige Riccios død. Astrologen svarer, at stjernerne vil fortælle ham, ikke mennesker, og forudsiger på sin side jesterens død. Med det forlader han. Dronningens side forårsaget af astrologen vises. Page elsker sin elskerinde. Astrologen fortæller ham at fortælle dronningen, at i dag vil den mand, hun elsker, dø. ”Hvordan, Botwell vil dø i dag?” - udbryder en side. Astrologen er forundret. Han havde Riccio i tankerne og skynder sig siden for at advare ham om dette. Efterladt alene undrer astrologen - det viste sig også af stjernene, at Botwell på en eller anden måde var mørkt forbundet med dronningen - gennem Mars, Saturn ... Botwell kommer ind. Fra hans monolog bliver det klart, at han uventet befandt sig i en astrologs hus. Når han indså, hvor han gik, spurgte Botwell astrologen, hvor meget han havde brug for at leve. Den gamle mand svarer, at tre år, og at Botwell vil være konge. Botwell tager en flaske gift ud, som han ønskede at begå selvmord med, ville smide den væk - og tøve. Faktisk, i atmosfæren af palads intriger, vil ethvert våben komme til nytte. Han tager af sted.
Siden fortæller dronningen, at Riccio snart kommer. Dronningen ser frem til ham - efter hendes mening forblev han alene tro mod hende. “Og Botvel?” Siden spørger. “Hvem er Botvel?” - dronningen er interesseret. En overrasket side fortæller Mary hvordan, mens sejlsport, en stærk vind plukkede en rose fra dronningens hoved, en blomst faldt i vandet. Og så skyndte en af hovmestrene - Botvel - sig ind i båden og jagede bange for roeren for at fange en rose fra vandet. Efter at have hørt historien, sender Mary en side for at bede. Hun tilstår for Gud, at hun ikke har mere styrke til at modstå sin kærlighed til Botwell. Dronningen ved, at hun ved retten betragtes som forelsket i Riccio. Riccio kommer ind. Mary rapporterer om en dødelig fare, der truer ham og koldt siger farvel til ham, der angiver ham skibet, der vil føre ham til Rom. I desperation forsøger Riccio at bede dronningen om at annullere beslutningen om at forlade. Dronningen er fast.
Heinrich, Morton og Lindsay lærte om Riccios forestående afgang og skyndte sig at dræbe ham eller lade ham sejle. Så dukker Douglas op og rapporterer, at Riccio allerede har sejlet. Douglas i fortvivlelse, han længes efter blodig hævn, hans ridderlige ære er såret. Pludselig møder de en side, der bringer dronningen en note fra Riccio - han forlod ikke og vil være med hende om aftenen. Konspiratorerne fjerner noten.
Maria har travlt med at brodere på sit værelse. Riccio, der kom, forklarer hende, at han ikke kunne rejse, fordi han har en duel med Douglas om morgenen. Han indrømmer, at han ikke har brug for livet uden hendes kærlighed. Han beder Mary om at give ham en krans af roser - han vil plante blomster på alteret i Rom ... Henry, Douglas og Dindsay kommer ind og dræber Riccio. Dronning besvimer. Douglas er ramt af skam og rædsel - han går frivilligt tilbage i eksil. Henry er bekymret for, om dronningen vil hader ham. Lindsay tager kongen væk og hvisker til ham om den kommende jagt. Dronning Botwell er inviteret af dronning. Mary kommer til hendes sans, ser Botvel og erkender sin kærlighed til ham. Botvægen tvinger hende til at indrømme, at hun ønsker Henrys død og giver hende sin flaske gift, idet han siger, at dette er en sovepille. Mary giver kongen denne "medicin", men giften drikker buffonen. Intet kan dog stoppe den morderiske intrige - Botwell sprænger kong Henrys hus. I det fjerne høres folkets voksende råb. Botlen med dronningen skjuler sig.